文章來源：H. Pahlevaninezhad , A. M. D. Lee , C. Hyun - Spie Bios – 2013 Proc. of SPIE Vol. 8565 85652S-2
本文以實驗結合光學軟件FRED來驗證熒光介質上覆蓋散射層的影響，結合AF-OCT系統能夠減少由于上皮組織增厚引起的假陽性，增強AF疾病檢測的功效。
摘要：
在本文中，我們通過模擬組織的自發熒光（AF）特性進行了模型的研究。我們組合了光學相干斷層掃描（OCT）和AF成像系統，依據散射層的厚度和濃度來測量AF信號的強度。使用由生成的OCT圖像計算得到的厚度和散射濃度，結合AF-OCT系統能夠估計由上皮組織散射引起的AF損耗。我們定義了一個校正因子來計算上皮組織中的散射損耗，并且計算了一個校正散射AF信號。我們認為校正散射AF將會減少在早期呼吸道病變檢測中的診斷誤檢率，誤檢是由混合因子產生，如增加的皮層厚度和炎癥。
關鍵詞：光學相干斷層掃描；自發熒光；光散射；模型；光線光學；OCT A-line數據
1. 簡介
自發熒光（AF）成像是一項已實現的技術，使用藍光來激發自然組織熒光。通過收集高風險區域進行活檢識別，已經證明這項技術對于癌癥的早期檢測和癌的分期是及其有效的。雖然通過白光成像可以容易的檢測浸潤癌，原位癌和高度的癌前病變的檢測卻十分棘手。白光成像中的變化十分微小，然而，AF成像可以清楚地對比這種病變。當受到藍光照射時，正常的組織會發出強烈的綠色AF，而異常組織則缺少這種AF輻射。
盡管AF成像可以方便的檢測原位癌，對于良性組織的異�，F象也是十分敏感的。例如，上皮組織的厚度未必就與癌癥相關，但是它確實減少了由散射產生的AF信號，導致了假陽性。因此，將癌癥與其他非危險異�，F象區別開來可以極大地增加治療的療效。
光學相干斷層掃描（OCT）是可以獲得生物組織皮下圖像的一項相干技術，它可以提供小于10μm軸向分辨率和大約3mm穿透深度的圖像。OCT采用了非電離，通常是近紅外的輻射來捕獲組織形態的實時圖像。OCT可以用于研究高風險的組織位置。因此，當用于組合時，以一種同時和協作的形式，AF-OCT成像可以提供豐富的生化信息，并定位組織形態，這些不能通過單獨的成像模式獲得。比如，在上皮組織增厚的情況下，OCT可以直接測量上皮組織厚度，并且將AF信號衰減歸因于上皮增厚，而不是癌癥前期引起的膠原重建。因此，由OCT給定結構信息，并結合AF-OCT可以減少AF假陽性。
AF信號強度不僅取決于原位的熒光，也取決于不同組織層的光吸收和散射。組織的光散射已經經過了深入的研究1-6。模擬組織散射可以提供與AF信號強度有價值的信息。由于價格低廉、方便校準且易于獲得，英脫利匹特（Intralipid）是用于組織模型最常見的散射媒介。這項工作的目的是根據散射層的厚度模擬組織自發熒光的性質。我們定義了一個AF信號校正因子，用來說明散射層引起的損耗。OCT圖像給出了散射層厚度和散射顆粒的濃度，這是校正因子計算所需的兩個因素。因此，我們提出了AF-OCT系統，作為癌癥檢測的一個更靈敏和精確的成像工具。
首先，我們解釋了Intralipid模型研究，旨在模擬不同上皮厚度的組織散射特性。然后，使用光線光學仿真來驗證實驗結果。使用AF和OCT數據計算AF校正因子將在最后一章解釋。
2. 實驗步驟
我們建立了一個能夠結合OCT和AF成像的雙態成像系統，OCT圖像測量Intralipid膜的厚度和濃度，AF圖像給出相應的AF信號強度。因此，AF-OCT成像可以映射不同濃度下AF強度和Intralipid厚度的關系。
OCT光激發使用一個30mW基于多邊形掃描儀的掃描波長的激光光源，具有106.8nm的帶寬，中心波長為1321.4nm。 激光光源為一個基于光纖的具有參考臂和樣品臂的馬赫澤德干涉儀（MZI），如圖1所示（OCT部分）。平衡的光電探測器（ThorLabs）檢測干涉。另一個MZI單元在光源處使用，來產生樣品的參考時鐘。探測器輸出和MZI時鐘注入到數字轉換器卡（AlazarTech）中，實現信號處理和創建OCT圖像。
AF成像系統使用一個40mW的半導體激光器（相干），在446nm處激發熒光。使用兩個1英寸直徑的透鏡和一個基于APD的探測器（Hamamatsu）來收集再發射的AF光子。二向色性的濾波片從AF光子中分離出后向散射的藍光，如圖1所示（AF部分）。通過在自由空間的背面拋光寬板電介質反射鏡（ThorLabs），OCT和AF光信號可以實現結合和分離。電流掃描鏡提供了樣品AF和OCT光束共同的2維掃描。
圖1.AF-OCT成像系統
我們的模型，如圖2（b）所示，包括一個直徑為1英寸的�。�1mm高）圓柱壁，它安裝在一個熒光載玻片上，以及圓柱壁中包圍著的Intralipid液體。改變容器中Intralipid的量會產生不同的Intralipid膜厚度，由OCT圖像測得。選擇封閉的圓柱壁時，高度要低，直徑要大，這樣就可以得到小的Intralipid膜厚度（μm范圍），同時在容器的中心區域可以接近扁平的表面以避免半月板和透鏡效應。圖2（a）顯示了在熒光載玻片上Intralipid膜的AF信號和OCT圖像。Intralipid膜的厚度和相對應的AF信號可以從圖中容易地獲得。
圖2.（a）在熒光載玻片上Intralipid膜的AF信號和OCT圖像，（b）Intralipid模型由在熒光載玻片上的圓柱壁及其中包含的Intralipid組成。
3. 光線光學仿真
使用來自Photon Engineering公司的商業軟件包FRED，我們將實驗的結果與光線光學仿真的結果進行比較。圖3顯示了仿真的配置和組件，包含一個藍色的激光光源（446nm）、一個熒光載玻片、一個Intralipid膜、用于聚焦藍光到樣品上和收集重新發射的AF光子的1英寸透鏡（焦距40mm）、一個遠離透鏡50cm的探測器，模仿實驗的裝置。探測器只對大于500nm的波長敏感，以此分離AF光子和后向散射的藍光。
熒光載玻片由一個散射介質模擬，對于每個具有425nm–490nm波長范圍的入射光子，通過散射介質的“平均自由程”后，散射介質會在隨機方向重新發射一個550nm的光線。使用數量巨大的光線，重新發射光子的隨機方向模仿由點光源產生的球面波，等價于熒光輻射。平均自由程決定了入射光滲透到載玻片內部的深度。Intralipid膜由具有各向異性（g）和散射系數（(μs）的Henyey-Greenstein體散射模型來模擬。
圖3.包含一個熒光載玻片、一個Intralipid膜、一個1英寸透鏡、一個激光光源和一個探測器的光線光學仿真裝置。
4. 結果和討論
圖4（a）比較了10% Intralipid實驗結果和光線光學的仿真結果。Intralipid模型仿真需要散射參數（g, μs）。散射系數7-19的理論計算和實驗測量在許多論文中已經提出。然而，文獻中報道的g和μs的值是變化的。我們使用在引用最多的文章中提出的數值來運行仿真，也就是van Staveren, et al8、Michels, et al17和Flock, et al19。在實驗和仿真的情況下，所有的AF信號都歸一化沒有Intralipid膜的AF數值，來隔離Intralipid膜對AF信號的影響。使用由Flock, et al19給出的Intralipid散射參數，我們實驗結果顯示出與仿真結果幾乎完美的匹配。然而，使用van Staveren, et al8和Michels, et al17提出的散射參數，比我們實驗測量建議產生了更多的AF損耗。
圖4.（a）AF信號隨Intralipid厚度變化曲線，來自實驗（藍色圓）和對10%Intralipid使用由Flock（紅色方塊）、van Staveren（綠色三角）和Michels（紫色方塊）提出的散射參數的光線光學仿真，（b）對于不同的Intralipid濃度，實驗AF信號隨Intralipid厚度變化曲線。
圖4（b）是對于不同的Intralipid濃度， 實驗AF信號隨Intralipid厚度變化曲線。正如預期，20%的Intralipid會引起激發藍光的劇烈散射，重新發射AF會隨著Intralipid厚度的增加急劇下降，然而，在較低的Intralipid濃度處，AF信號的損耗是比較少的。知道了Intralipid濃度，圖4（b）記錄了Intralipid膜引起的信號衰減，這可以用于AF校正因子。因此給定一個Intralipid濃度，AF信號的校正因子可以從圖4（b）中估計得到。
根據事實高濃度會導致嚴重的信號振幅的衰減，OCT A-scan數據可以給出Intralipid濃度，然而，對于低濃度這種衰減很低。圖5（上）顯示了不同濃度下的OCT A-scan。A-scan數據（藍色圓）曲線擬合到e-at函數（綠色實線），產生衰減系數（a）隨Intralipid濃度的變化曲線，如圖5（下）所示。OCT數據可以測量散射顆粒（圖5b）的濃度，有助于找到圖4中對應的曲線。舉個例子，具有2.6mm-1OCT A-line損耗的樣品對應于大約5%的濃度的散射顆粒。因此，AF校正因子可以由圖4（b）的紅色曲線確定。所以對于觀察到的AF信號，AF-OCT系統提供了足夠的信息來計算校正因子，從而可以用于減少較厚散射層引起的AF假陽性。
圖5.上：OCT A-line數據（圓）曲線擬合到e-at（綠色實線），下：從OCT A-line數據得出的損耗系數a隨Intralipid濃度的變化曲線。
5. 結論
我們進行了一項Intralipid模型研究，使用組合的AF-OCT系統模擬了熒光介質上覆蓋散射層的影響。對于不同的散射顆粒的濃度，呈現出隨著散射層厚度變化的AF損耗曲線。OCT成像用于計算散射層厚度和濃度，以及估計AF信號損耗所需的參數。模型用于從散射層引起的損耗計算AF信號衰減的校正因子。因此，結合AF-OCT系統能夠減少由于上皮組織增厚引起的假陽性，增強AF疾病檢測的功效。
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